Gran avance en la microscopía de fluorescencia de superresolución

Los científicos dirigidos por el premio Nobel Stefan Hell en el Instituto Max Planck de Investigación Médica en Heidelberg han desarrollado un microscopio de súper resolución con una precisión espacio-temporal de un nanómetro por milisegundo. Una versión mejorada de su microscopía de superresolución MINFLUX recientemente presentada permitió observar pequeños movimientos de proteínas individuales con un nivel de detalle sin precedentes: el movimiento escalonado de la proteína motora kinesina-1 mientras camina a lo largo de los microtúbulos mientras consume ATP. La obra, publicada en Cienciadestaca el poder de MINFLUX como una nueva herramienta revolucionaria para observar cambios conformacionales de tamaño nanométrico en proteínas.

Desentrañar el funcionamiento interno de una célula requiere el conocimiento de la bioquímica de las proteínas individuales. Medir pequeños cambios en su posición y forma es el desafío central aquí. La microscopía de fluorescencia, en particular la microscopía de súper resolución (es decir, la nanoscopía), se ha vuelto indispensable en este campo emergente. MINFLUX, el sistema de nanoscopia de fluorescencia presentado recientemente, ya ha alcanzado una resolución espacial de uno a unos pocos nanómetros, el tamaño de las moléculas orgánicas pequeñas. Pero llevar nuestra comprensión de la fisiología celular molecular al siguiente nivel requiere observaciones con una resolución espacio-temporal aún mayor.

Cuando el grupo de Stefan Hell presentó por primera vez MINFLUX en 2016, se había utilizado para rastrear proteínas marcadas con fluorescencia en las células. Sin embargo, estos movimientos eran aleatorios y el seguimiento tenía precisiones del orden de decenas de nanómetros. Su estudio es el primero en aplicar el poder de resolución de MINFLUX a los cambios conformacionales de las proteínas, específicamente la proteína motora kinesin-1. Para hacer esto, los investigadores del Instituto Max Planck de Investigación Médica desarrollaron una nueva versión de MINFLUX para rastrear moléculas fluorescentes individuales.

Todos los métodos establecidos para medir la dinámica de proteínas tienen limitaciones graves, lo que dificulta su capacidad para abordar el rango de (sub) nanómetros / (sub) milisegundos de importancia crítica. Algunos proporcionan una alta resolución espacial, de unos pocos nanómetros, pero no pueden rastrear los cambios lo suficientemente rápido. Otros tienen una alta resolución temporal pero requieren el etiquetado con perlas que son de 2 a 3 órdenes de magnitud más grandes que la proteína que se está estudiando. Dado que es probable que el funcionamiento de la proteína se vea comprometido por una perla de este tamaño, los estudios que utilizan perlas dejan preguntas abiertas.

Fluorescencia de una sola molécula

MINFLUX, sin embargo, requiere solo una molécula de fluorescencia de tamaño estándar de 1 nm como etiqueta adherida a la proteína y, por lo tanto, puede proporcionar tanto la resolución como la invasividad mínima que se necesitan para estudiar la dinámica de proteínas nativas. «Un desafío radica en construir un microscopio MINFLUX que funcione cerca del límite teórico y esté protegido contra el ruido ambiental», dice Otto Wolff, Ph.D. estudiante en el grupo. «Diseñar sondas que no afecten la función de la proteína, pero que revelen el mecanismo biológico, es otra», agrega su colega Lukas Scheiderer.

El microscopio MINFLUX que ahora presentan los investigadores puede registrar los movimientos de proteínas con una precisión espaciotemporal de hasta 1,7 nanómetros por milisegundo. Requiere la detección de solo unos 20 fotones emitidos por la molécula fluorescente. «Creo que estamos abriendo un nuevo capítulo en el estudio de la dinámica de las proteínas individuales y cómo cambian de forma durante su funcionamiento», dice Stefan Hell. «La combinación de alta resolución espacial y temporal proporcionada por MINFLUX permitirá a los investigadores estudiar biomoléculas como nunca antes».

Resolución del movimiento escalonado de la kinesina-1 con ATP en condiciones fisiológicas

Kinesin-1 es un jugador clave en el transporte de carga a través de nuestras células, y las mutaciones de la proteína están en el corazón de varias enfermedades. Kinesin-1 en realidad «camina» a lo largo de filamentos (los microtúbulos) que se extienden por nuestras células como una red de calles. Uno puede imaginar el movimiento como literalmente «paso a paso», ya que la proteína tiene dos «cabezas» que cambian alternativamente su ubicación en el microtúbulo. Este movimiento ocurre generalmente a lo largo de uno de los 13 protofilamentos que forman el microtúbulo y es alimentado por la división del principal proveedor de energía de la célula, ATP (trifosfato de adenosina).

Usando un solo fluoróforo para marcar la kinesina-1, los científicos registraron los pasos regulares de 16 nm de las cabezas individuales, así como los subpasos de 8 nm, con una resolución espaciotemporal de nanómetros/milisegundos. Sus resultados demostraron que el ATP se absorbe mientras una sola cabeza está unida al microtúbulo, pero que la hidrólisis del ATP ocurre cuando ambas cabezas están unidas. También reveló que el paso implica una rotación del «tallo» de la proteína, la parte de la molécula de cinesina que contiene la carga. La resolución espacio-temporal de MINFLUX también reveló una rotación de la cabeza en la fase inicial de cada paso. Significativamente, estos hallazgos se realizaron usando concentraciones fisiológicas de ATP, algo que hasta ahora no era posible con etiquetas de fluorescencia diminutas.

«Estoy emocionada por ver adónde nos llevará MINFLUX. Agrega otra dimensión al estudio de cómo funcionan las proteínas. Esto puede ayudarnos a comprender los mecanismos detrás de muchas enfermedades y, en última instancia, contribuir al desarrollo de terapias», agrega Jessica Matthias, un científico postdoctoral anteriormente en el grupo de Hell que ahora está explorando las aplicaciones de MINFLUX a una variedad de preguntas biológicas.