Los plásmidos tienen un amplio uso en biología básica y aplicada. Los científicos utilizan estas pequeñas moléculas circulares de ADN para introducir nuevos genes en un organismo objetivo. Conocidos por sus aplicaciones en la producción de proteínas terapéuticas como la insulina, los plásmidos se utilizan ampliamente en la producción a gran escala de muchos bioproductos.
Sin embargo, el diseño y la construcción de plásmidos sigue siendo uno de los pasos más laboriosos y laboriosos de la investigación biológica.
Para abordar esto, Behnam Enghiad, Pu Xue y otros investigadores de la Universidad de Illinois Urbana-Champaign en el Centro de Innovación Avanzada de Bioenergía y Bioproductos (CABBI) han desarrollado una plataforma versátil y automatizada para el diseño y construcción de plásmidos llamada PlasmidMaker. Su trabajo fue publicado recientemente en Comunicaciones de la naturaleza.
La creación de un plásmido comienza con el diseño. Para ayudar en este proceso de diseño, PlasmidMaker tiene una interfaz web fácil de usar con la que los investigadores pueden visualizar y ensamblar intuitivamente el plásmido perfecto para sus necesidades.
Una vez que se ha diseñado el plásmido, se envía al equipo de PlasmidMaker y se realiza un pedido del plásmido en Illinois Biological Foundry for Advanced Biomanufacturing (iBioFAB), donde se construirá el plásmido. iBioFAB, ubicado en el Instituto Carl R. Woese de Biología Genómica (IGB) en el campus de la U de I, es una infraestructura física y computacional totalmente integrada que admite la fabricación rápida, el control de calidad y el análisis de construcciones genéticas. Cuenta con un brazo robótico central que transfiere material de laboratorio entre instrumentos que realizan distintas operaciones como pipeteo, incubación o termociclado.
El proceso de creación de plásmidos está automatizado: las muestras se preparan mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la purificación, la secuencia de ADN se ensambla y transforma, y los plásmidos se confirman y congelan, todo con poca participación humana.
Además de la automatización y la precisión que ofrece iBioFAB, la plataforma PlasmidMaker también es pionera en un nuevo método altamente flexible para ensamblar múltiples fragmentos de ADN en un plásmido utilizando Pyrococcus furiosus Argonauta (P.f.Ago) basadas en enzimas de restricción artificiales (ARE).
Las enzimas de restricción se han utilizado durante mucho tiempo en la construcción de plásmidos, ya que pueden escindir moléculas de ADN en secuencias específicas de bases, denominadas secuencias de reconocimiento. Sin embargo, estas secuencias de reconocimiento suelen ser cortas, lo que dificulta trabajar con ellas. Es probable que una secuencia corta ocurra varias veces en una molécula de ADN, en cuyo caso la enzima de restricción haría demasiados cortes.
«En los métodos de ensamblaje de ADN anteriores, a menudo sería difícil encontrar las enzimas de restricción adecuadas que pudieran cortar el plásmido y reemplazar los fragmentos de ADN», dijo Huimin Zhao, coautor y presidente de Steven L. Miller de Ingeniería Química y Biomolecular ( ChBE) en Illinois. «Él P.f.Los ARE basados en Ago ofrecen una mayor flexibilidad y precisión, ya que pueden programarse para buscar secuencias de reconocimiento más largas en prácticamente cualquier sitio».
Con todas las mejoras que aporta, los miembros del equipo de CABBI, uno de los cuatro Centros de Investigación de Bioenergía financiados por el Departamento de Energía de los Estados Unidos, esperan que PlasmidMaker acelere el desarrollo de la biología sintética para aplicaciones biotecnológicas.
«Esta herramienta estará disponible para los investigadores de CABBI, y queremos que eventualmente esté disponible para todos los investigadores en los otros tres Centros de Investigación de Bioenergía», dijo Zhao. «Si las cosas van bien, esperamos que esté disponible para todos los investigadores en todas partes».
Los otros coautores del manuscrito son Nilmani Singh, ingeniero de automatización de CABBI; Aashutosh Girish Boob y Chengyou Shi, estudiantes graduados de CABBI en ChBE; Vassily Andrew Petrov, ingeniero de software de CABBI; Roy Liu, estudiante de pregrado en Ingeniería Informática de CABBI; Siddhartha Suryanarayana Peri, estudiante de pregrado de CABBI en ChBE; Stephan Thomas Lane, Gerente de CABBI iBioFAB; y Emily Danielle Gaither, ex técnica de CABBI iBioFAB.